Лаборатория энзимологии

Заведующий лабораторией

Кульминская Анна Алексеевна, кандидат биологических наук
Kulminskaya_AA@pnpi.nrcki.ru

Основные направления деятельности

Исследования механизмов и особенностей гидролаз микробного происхождения
  • ферментов лигноцеллюлолитического комплекса: ксиланазы, ксилозидазы, целлобиогидролазы, целлюлазы/глюканазы;
  • альфа-галактозидазы из Thermotoga maritima;
  • альфа-L-фукозидазы и сульфатазы из Fusarium proliferatum;
  • поиск и характеристика микробных продуцентов фермента уреазы для кальцинирования цементных поверхностей.
Разработка способов применения ферментов
  • использование трансгликозилирующей способности гликозидгидролаз;
  • разработка биореакторов на основе иммобилизованных ферментов.
Исследования влияния полисахаридов на клетки
  • разработка материалов медицинского назначения на основе биополимеров растительного и микробного происхождения и оценены эффективность и безопасность этих продуктов на моделях термического поражения кожных покровов и прилегающих тканей III степени тяжести, а также раневых поверхностях.
Белки и нейродегенеративные заболевания
  • Исследования структуры и механизмов действия белков, вовлеченных в НДЗ

Основные задачи

 

Основные результаты

  • Определено новое таксономическое положение криптического вида мицелиального гриба, ранее известного, как Geotrichum candidum 3C, являющимся эффективным продуцентом лигноцеллюлолитических ферментов. На основе анализа данных поискового алгоритма BLAST для последовательностей филогенетических маркеров 18S SSU, 28S LSU, RPB2, ITS и построенного мультигенного филогенетического дерева с использованием маркеров 18S SSU, ITS и RPB2, а также подробных исследований морфологических характеристик исследуемого штамма и его биохимических особенностей с использованием микроскопии, стандартных методов культивирования микроорганизмов и сравнительных исследований представителей рода Scytalidium было предложено называть его Scytalidium candidum comb. nov. 3C. Штамм микроорганизма депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (RCAM) под регистрационным номером RCAM04653.
  • В результате структурной аннотации генома S. candidum 3C и последующей функциональной аннотации CAZy-мов (углевод-активных ферментов по классификации CAZy, http://cazy.org ) были обнаружены предполагаемые последовательности генов, кодирующих такие белки. Установлено, что общее количество генов, кодирующих CAZy-мы, составляет 197, из них идентифицировано 110 гликозидгидролаз, 52 гликозилтрансферазы, 29 окислительных ферментов и 6 углеводэстераз. Кроме того, было найдено 25 нуклеотидных последовательностей, кодирующих субстрат-связывающие домены. Установлено, что в условиях культивирования S. candidum 3C на среде с бумагой секретируются, в основном, целлюлазы, включающие эндо-β-1,4-глюканазы, целлобиогидролазы и β-глюкозидазы. Установлено наличие пептидов, идентичных 39 гликозидгидролазам, трем белкам без известной ферментативной функции, принадлежащим этой же категории семейств, 11 окислительным ферментам и трем гликозилтрансферазам. С помощью специально синтезированных тио-субстратов выявлено шесть гемицеллюлаз: четыре β-ксиланазы из 10-го семейства и две β-глюканазы из 7-го и 55-го семейств гликозидгидролаз. Обнаруженный набор нуклеотидных последовательностей ферментов лигноцеллюлолитического комплекса позволяет утверждать, что мицелиальный гриб S. candidum 3С конкурентоспособен по своей эффективности с такими известными продуцентами подобных ферментов, как Trichoderma reesei и Aspergillus niger. Полученные нами результаты дают возможность более подробно и направленно исследовать комплекс ферментов мицелиального гриба S. candidum 3С, разрушающих полисахариды растительной стенки.
  • Выделены и детально охарактеризованы три целлобиогидролазы (ЦБГ) из штаммов рода Trichoderma. Установлено, что первоначальный гидролиз бактериальной целлюлозы был быстрее с TatCel7A, чем ThaCel7A или TreCel7A. При синергетическом осахаривании предварительно обработанной кукурузной шелухи ЦБГ-зы TatCel7A и ThaCel7A оказались более эффективными, чем TreCel7A, хотя TatCel7A была более чувствительна к термической инактивации. Наивысшую конверсию удалось достичь с помощью TatCel7A и ThaCel7A, которые оказались более эффективными, чем TreCel7A.
  • Из культуральной жидкости мицелиального гриба S. candidum 3C была выделена и очищена до гомогенного состояния секретируемая β-ксиланаза, имеющая две основные формы гликозилирования. На основании анализа аминокислотной последовательности фермент был классифицирован, как представитель 10 семейства гликозидгидролаз. Установлено, что фермент обладает наибольшей активностью в очень кислом диапазоне рН 3 — 3,5 и сохраняет более 90 % активности в диапазоне рН 3 — 7. Анализ продуктов реакции трансгликозилирования с использованием о-нитрофенил ксилобиозида в качестве субстрата методом ТСХ и ВЭЖХ, показал появление о-нитрофенил ксилоолигосахаридов с большей степенью полимеризации, чем исходный субстрат возникающих в результате трансгликозилирующей активности фермента.
  • Методами электрофореза, вестерн-блота и изофокусирования показано, что с течением времени меняется не только удельная активность рекомбинантной сульфатазы из Fusarium proliferatum LE1, но и его масса и изоэлектрическая точка. Установлено, что при термообработке белка не происходит его диссоциация на субъединицы, а его инактивация происходит за счёт необратимых структурных изменений, происходящих целиком в тетрамере. Установлено, что холин-сульфат и 2-сульфоэтиламмоний являются субстратами для исследуемого фермента. При этом удельная активность рекомбинантной сульфатазы в гидролизе холин-сульфата составила 3.79·10-2 ед/мг. Показано, что замена цистеина, расположенного в активном центре сульфатазы, на аланин и треонин приводит к потери каталитической активности фермента, что позволяет сделать вывод о необходимости данной аминокислоты для осуществления катализа.
  • Разработана схема получения минорной рекомбинантной альфа-фукозидазы из Fusarium proliferatum LE1 и определены ее основные физико-химические характеристики.
  • Осуществлен сравнительный анализ биологической активности исходного фукоидана и частично деполимеризованных образцов на клеточных линиях Hep G2 и Chang liver. Было показано, что наибольшую эффективность в отношении обеих клеточных линий проявлял образец низкомолекулярного фукоидана, полученный после гидролиза в течение 5 мин. Как исходный фукоидан, так и низкомолекулярные образцы ингибируют пролиферацию обеих клеточных линий после 48 ч культивирования в их присутствии, причем по сравнению с немалигнизированными клетками Chang liver опухолевые клетки печени Hep G2 проявили большую чувствительность к фукоидану из F. vesiculosus. Показано, что уменьшение молекулярного веса полисахаридов при практически одинаковой степени сульфатирования способствует увеличению противоопухолевой активности.

 

Публикации